食品中志賀氏菌要檢測哪些東西？志賀氏菌的檢測方法及標準解析

志賀氏菌病常為食物暴發型或經水傳播。和志賀氏菌病相關的食品包括色拉，生的蔬菜、奶和奶制品、禽肉、水果、面包、漢堡包及有鰭魚類。志賀氏菌在擁擠和不衛生條件下能迅速傳播，經常發現于人員大量集中的地方，如餐廳、食堂。因此食品檢測中志賀氏菌病檢測項目必不可少，那食品中志賀氏菌檢測方法及標準有哪些？

5 檢測方法

5.1 分離培養

增菌：稱取待檢樣品25g，加入裝有225mL志賀氏菌增菌肉湯的500mL廣口瓶內，固體食品應用均質器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品應用滅菌金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，于（36±1）℃培養6～8h。

分離培養：取增菌液1環，劃線接種于志賀氏菌選擇性瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養基上，于（36±1）℃培養18～24h。觀察平板或培養基上菌落形態，根據志賀氏菌在不同培養基上的菌落特征進行可疑菌落的判定。

5.2 生化鑒定

挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和半固體各一管。志賀氏菌屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果為底層變黃、不產氣（福氏志賀氏菌6型可微產氣），斜面不變色，不產生硫化氫，無動力；在半固體管內沿穿刺線生長。應進一步做苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶，西蒙氏檸檬酸鹽和葡萄糖銨尿素、KCN、水楊苷、七葉苷試驗，志賀氏菌屬均為陰性反應。必要時應做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌，并以生化試驗方法做4個生化群的鑒定。具有以上特性的菌株，疑為志賀氏菌，可做血清凝集試驗。

5.3 血清學分型

挑取三糖鐵瓊脂上的培養物，做玻片凝集試驗。先用4種志賀氏菌多價血清檢查，如果由于K抗原的存在而不出現凝集，應將菌液煮沸后再檢查，再用A1、A2、B群、多價D群血清分別試驗，如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查，確定菌型。福氏志賀氏菌型鑒定的方法：可先用群因子血清檢驗，再根據群因子血清出現凝集的結果，依次選用型因子血清檢查。4種志賀氏菌多價血清不凝集的菌株，可用鮑氏志賀氏菌多價血清1、2、3分別檢查，并進一步用1～15各型因子血清確定菌型，如果不是鮑氏志賀氏菌，可用痢疾志賀氏菌3～12型多價血清及各型因子血清檢查。

5.4 分子生物學鑒定

5.4.1 DNA模板的制備

取增菌液1mL于小離心管中，4000～5000r/min離心5min，棄上清液，向菌沉淀中加入50μL滅菌純水制成菌懸液，混勻后100℃煮沸10min，12000r/min離心5min，取上清液作為PCR模板。

5.4.2 引物設計

上游引物為5′-GTTCCTTGACCGTTCCGATACCGTC-3′；下游引物為5′-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′。擴增片段長度為629bp。

5.4.3 PCR反應體系

反應體積25μL：10×buffer2.5μL，TaqDNA聚合酶（2U/μL）0.5μL，MgCl2溶液（25mmol/L）3μL，dNTP（25mmol/L）1μL，ddH2O14μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10mol/L）1μL，模板2μL。

5.4.4 PCR反應參數

95℃預變性5min；95℃變性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃后延伸5min。4℃保存。

注：PCR反應參數可根據基因擴增儀型號的不同進行適當調整。

5.4.5 電泳

用核酸電泳緩沖液（TAE）制備1.8%～2.0%的瓊脂糖凝膠，取5μLPCR擴增產物，分別和2μL上樣緩沖液混合進行點樣，用DNA分子量標記物做參照，3～5V/cm恒壓電泳，電泳20～40min，電泳檢測結果用凝膠成像分析系統記錄并保存。

5.4.6 結果判定

在陰性對照未出現條帶、陽性對照出現預期大小的擴增條帶條件下，如待測樣品未出現629bp大小的擴增帶，則判為陰性；如待測樣品出現629bp大小的擴增帶，則判為陽性。

如果陰性對照和（或）陽性對照未出現預期大小的擴增條帶，則本次檢測結果無效，應重新試驗。

目前，針對志賀氏菌的特點和危害，國家衛生部已將志賀氏菌列入了肉、蛋、水產、飲料、調味品、糖果及酒類等食品的檢驗標準中。

并制定了與之相對應的檢測標準

食品中志賀氏菌檢測標準

《食品安全國家標準食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗》(GB4789.5-2012)。